TÓM TẮT

Chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM (Lở mồm long móng) có thể thực hiện khi bệnh xẩy ra tại khu vực đã được xác định là có dịch LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000). Hoặc căn cứ các đặc điểm dịch tễ như: tốc độ lây lan nhanh, tỷ lệ mắc cao, tỷ lệ chết thấp, động vật móng guốc chẵn đều mắc bệnh.

Triệu chứng chủ yếu là con vật sốt cao, chảy nước bọt nhiều, có biểu hiện què, có các mụn nước ở niêm mạc miệng, lợi, chân răng, lưỡi, kẽ móng, gờ móng, ở vú. Những gia súc mới khỏi bệnh thì trên niêm mạc  miệng, lợi, chân răng, lưỡi, kẽ móng... có các vết sẹo.

Tại những nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, triệu chứng lâm sàng chỉ có tính chất định hướng trong chẩn đoán và nhất thiết phải dùng biện pháp chẩn đoán bằng xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để khẳng định bệnh. Bệnh phẩm thích hợp để phân lập virus LMLM là biểu mô và dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ. Lượng tối thiểu phải từ 3-5g tổ chức tươi. Để phát hiện kháng thể thì bệnh phẩm là máu những con nghi mắc bệnh với lượng 3-5 ml, để máu đông chắt lấy huyết thanh. Bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Mẫu giám sát lưu hành virus là mẫu dịch hầu họng (Probang) bảo quản trong dung dịch BHI, MEM.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease, FMD) là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho chăn nuôi, vì đây là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho những động vật guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu và những loài động vật hoang dã. Bệnh có tính lây lan nhanh trên diện rộng cho nên tổ chức thú y thế giới đã xếp vào danh mục bảng A của bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất ở động vật. Virus gây bệnh LMLM thuộc họ Picornaviridae được chia thành 7 type huyết thanh, giữa các type không có miễn dịch chéo cho nhau.

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đối với các ổ dịch LMLM, trâu bò mắc bệnh sau khi hồi phục thường mang trùng. Trâu, bò có thể mang mầm bệnh ở thể mang trùng nhưng không có biểu hiện lâm sàng và đây là nguồn gây bùng phát các ổ dịch sau mỗi thời kỳ.

Ở nước ta hiện nay, nguy cơ bùng phát dịch LMLM còn rất cao do việc quản lý và xử lý gia súc mắc bệnh, gia súc chết không kịp thời, không đúng quy định làm cho mầm bệnh lưu hành, phát tán khắp nơi. Bên cạnh đó, việc mua bán, vận chuyển động vật và sản phẩm động vật mắc bệnh không được kiểm soát chặt chẽ; tỷ lệ tiêm phòng vắc xin không cao; mầm bệnh trong môi trường không được xử lý triệt để là những nguy cơ làm phát sinh dịch bệnh.

Bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, hươu, nai,... Bệnh do vi rút thuộc họ Picornaviridae gây ra, có khả năng lây lan nhanh, ở phạm vi rộng, không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đường khác nhau, kể cả qua không khí. Vì vậy, bệnh thường phát thành dịch và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội, môi trường của nhiều nước trên thế giới.

Hiện nay tỉnh Hà Tĩnh đã xác định sự lưu hành virus LMLM gồm 2 type O và A. Đây là vấn đề khó khăn cho chiến lược của tỉnh Hà Tĩnh trong phòng chống bệnh LMLM, sự lưu hành virus LMLM diễn biến rất phức tạp ở gia súc và nếu những gia súc này được bán đi nhiều nơi, dẫn đến virus LMLM phát tán tràn lan, dễ dàng gây ra các đợt dịch trầm trọng; ở nhiều địa phương, nhiều ổ dịch cũ mặc dù đã được tiêm phòng nhưng vẫn mắc đi, mắc lại, làm cho người dân không tin tưởng vào việc tiêm phòng.

II. NỘI DUNG

1. Phương pháp chẩn đoán virus học

 Dùng huyễn dịch bệnh phẩm (mụn nước, biểu mô...) nuôi cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BHK-21...), tiêm cho động vật thí nghiệm (chuột lang, bê,....), tiêm nội bì lưỡi bò trưởng thành, rồi theo dõi sự biến đổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tích của động vật thí nghiệm để xác định bệnh phẩm có chứa virus LMLM không.

2. Chẩn đoán bằng phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)

Phản ứng KHBT được thực hiện nhờ hệ thống dung huyết và hệ thống dung khuẩn với sự tham gia của bổ thể. Bởi vì, sự dung khuẩn mắt thường không nhìn thấy được, do vậy phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả qua quan sát bằng mắt thường.

- Huyết thanh miễn dịch của từng type được chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Tiêm vacxin LMLM của từng type virus LMLM khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột) hai lần mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt huyết thanh có chứa kháng thể.

- Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong môi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tương đương, khi tế bào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tích tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể (Nguyễn Tiến Dũng, 2000).

3. Chẩn đoán bằng các phản ứng trung hoà virus

Trong cơ thể động vật mắc bệnh, virus gây bệnh kích thích sản sinh ra kháng thể tương ứng, kháng thể này có khả năng trung hoà chính virus kích thích sinh ra nó, làm virus không còn khả năng gây bệnh thí nghiệm và phá hủy tế bào mẫn cảm.

Căn cứ vào việc có hay không có sự biến đổi tế bào sau khi cấy hỗn hợp kháng nguyên-kháng thể để xác định con vật không hay có bị bệnh và bị bệnh do type virus LMLM nào.

Phản ứng trung hoà virus thường rất nhạy và đặc hiệu, chỉ cần 2- 3 ngày là có kết quả nhưng nếu lượng huyết thanh ít, hiệu giá thấp, dương tính giả có thể xảy ra.

4. Chẩn đoán bằng phản ứng ELISA

Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao (Crowther J.R. và Abu Elzein E.M.E., 1979; Hamblin C. Và cộng sự, 1987; Have. P. và Jensen M.H., 1983; Roeder P. và Le Blanc Smith P.M., 1987).

4.1. Nguyên lý     

Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào.

Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym không bị rửa trôi, enzym sẽ phân giải cơ chất để tạo màu, khi có màu trong quang phổ kế thì sẽ định lượng được mức độ phản ứng.

4.2. Phân loại phản ứng ELISA  

Phản ứng ELISA được phân thành ba loại chính như sau:

- Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): Dùng kháng thể gắn enzym để xác định kháng nguyên nghi cố định trên đĩa chuyên dụng.

- Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Dùng kháng nguyên chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi.

- Phản ứng sandwich ELISA gồm 2 loại:

+ Phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp (direct Sandwich ELISA): Kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể gắn emzym.

+ Phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp (indirect Sandwich ELISA): Kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể nghi, sau đó kháng thể nghi được nhận diện bằng kháng kháng thể loài gắn enzym.

4.3. Ứng dụng phản ứng ELISA trong chẩn đoán bệnh LMLM

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên virus LMLM

Phương pháp ELISA thường được sử dụng để xác định sự có mặt của kháng nguyên virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm lấy từ gia súc bị nghi ngờ nhiễm virus.

Kháng nguyên của virus LMLM có thể xác định bằng phương pháp ELISA trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm biểu mô hay dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ.

Còn mẫu được lấy từ nơi chứa ít virus hay chất lượng mẫu không đảm bảo thì trước khi định type virus bằng phương pháp ELISA sẽ tiến hành nuôi cấy virus trên môi trường tế bào sau đó phân lập virus từ môi trường nuôi cấy.

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM

Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để phát hiện và giám định các serotype của virus LMLM trong huyết thanh gia súc. Trong phản ứng, mỗi đĩa  ELISA chỉ làm với một type virus LMLM chuẩn, để phát hiện kháng thể nghi trong huyết thanh của gia súc cần chẩn đoán.

Có thể sử dụng cả ba phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus LMLM. Nhưng hiện nay, phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp thường được sử dụng phổ biến hơn cả. Bởi vì, kĩ thuật ELISA này có thuận lợi hơn hẳn các phản  ứng thông thường khác do có tính đặc hiệu rất cao, rất nhạy lại kinh tế vì nhiều ứng dụng:

+ Trong chẩn đoán phát hiện bệnh, với phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp chúng ta có thể phát hiện và định type kháng nguyên virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm biểu mô, dịch tiết hay có thể phát hiện kháng thể và giám định serotype virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm huyết thanh.

+ Đối với gia súc đã tiêm phòng vắc xin, để đánh giá khả năng đáp ứng miễn  dịch của gia súc sau tiêm phòng cũng như hiệu quả sử dụng vắc xin người ta cũng sử dụng phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp để định lượng kháng thể kháng virus LMLM.

- Phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA)

Trong chẩn đoán huyết thanh học, phương pháp Sandwich ELISA gián  tiếp được sử dụng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là phương pháp LPB - ELISA. Phương pháp này được nghiên cứu và đưa ra lần đầu tiên bởi Hamblin và cộng sự vào năm 1986. Độ nhạy của phản ứng LPB - ELISA tương đương với phản ứng trung hòa virus nhưng lại không phải nuôi cấy tế bào trong xét nghiệm. Do đó, đây là một phương pháp xét nghiệm hiệu quả, an toàn và ít tốn kém hơn so với phương pháp trung hòa virus rất nhiều.

Kỹ thuật chẩn đoán này cho kết quả nhanh trong vòng 3-4 giờ, không phụ thuộc môi trường mô, tỷ lệ phần trăm dương tính giả thấp. Do có thể sử dụng kháng nguyên vô hoạt nên xét nghiệm được với số lượng chủng virus nhiều hơn.

Hiện nay, để thuận lợi cho việc chẩn đoán tại các phòng thí nghiệm, người ta  đã sản xuất các bộ kít chẩn đoán dựa trên kỹ thuật LPB - ELISA. Các thành phần và nguyên liệu cho phản ứng vẫn có thể thực hiện được xét nghiệm dễ dàng. Có hai loại bộ kít đã được sản xuất là bộ kít LPB - ELISA bao gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 7 serotype virus và bộ kít LPB - ELISA phát hiện 3 hoặc 4 serotype virus LMLM.  

Hiện bộ kít LPB - ELISA chẩn đoán đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4 serotype virus O, A, C và Asia1.

4.4. Phương pháp NSP - ELISA (Non Structural Protein ELISA)

Những năm trước đây Tổ chức Thú y thế giới (OIE) vẫn còn chưa có hướng dẫn quy trình chính thức để phân biệt gia súc bị nhiễm virus (sau khi đã lành bệnh) với gia súc đã tiêm phòng vắc xin LMLM. Các phương pháp huyết thanh học chính thức được hướng dẫn chỉ để định lượng kháng thể kháng protein cấu trúc (Structural proteins – SP) của virus LMLM, nhưng không thể phân biệt kháng thể tạo ra do gia súc nhiễm bệnh LMLM hay do tiêm phòng vắc xin.

Tìm các phương pháp huyết thanh học có thể phân biệt kháng thể có trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM với kháng thể có trong huyết thanh của gia súc được tiêm phòng vắc xin là trọng tâm nghiên cứu trong nhiều thập niên qua.

Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu và tìm ra được một phương pháp phát hiện được kháng thể có trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM, kể cả những con vật đã được tiêm phòng vắc xin. Đây là phương pháp ELISA định lượng kháng thể kháng kháng nguyên không cấu trúc (Non-structural Proteins-NSP) của virus LMLM trong huyết thanh gia súc. Phương pháp này được gọi là phương pháp NSP - ELISA.

Phương pháp NSP-ELISA được dùng trong chẩn đoán phân biệt kháng thể trong huyết thanh của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phòng vắc xin.

Phương pháp NSP-ELISA dựa trên nguyên lý sau: Sau khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo thành các hạt virus mới, vừa tạo ra các thành phần không tham gia kết hợp thành các hạt virus mới mà chỉ đóng vai trò các enzym giúp cho quá trình nhân lên. Các thành phần kết hợp thành bản thân các hạt virus có tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên cấu trúc (SP). Các thành phần không tham gia kết hợp thành các hạt virus mới có tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên không cấu trúc (NSP).

Trong đó, một số kháng nguyên không cấu trúc có khả năng kích thích gia súc tạo ra kháng thể với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh (nhất là trâu bò) đã nhiễm bệnh. Còn gia súc được tiêm phòng vắc xin, đặc biệt những loại vắc xin vô hoạt có độ tinh khiết cao (đã được loại bỏ những kháng nguyên không cấu trúc) sẽ chỉ sản sinh kháng thể đặc hiệu chống virus LMLM chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc. Vì vậy, việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên không cấu trúc cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM.

Phương pháp NSP – ELISA được sử dụng chẩn đoán cho nhiều loại gia súc như trâu bò, dê, cừu. Kháng nguyên không cấu trúc xuất hiện sớm nhất sau 8 ngày nhiễm virus ở trâu bò và 10 ngày ở dê cừu. Với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên không cấu trúc của virus LMLM, chúng ta có thể xác định được động vật nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào, cả những con chưa tiêm hay đã tiêm phòng vắc xin, những con không có triệu trứng lâm sàng, thậm chí cả ngay khi ổ dịch nổ ra 1 năm.

Phương pháp NSP-ELISA hoàn toàn nhạy khi sử dụng chẩn đoán cho một  đàn gia súc với số lượng lớn. Nhiều bộ kít chẩn đoán dựa trên kĩ thuật NSP-ELISA của các hãng khác nhau trên thế giới đã được sản xuất và sử dụng. Nhưng đến 10/2001 sau  nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã chính thức công nhận bốn bộ kít chẩn đoán có độ chính xác và đặc hiệu cao trong chẩn đoán xác định gia súc nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phòng vắc xin là: Chekit- FMD-3ABC của Bommeli Diagnostics, FMDV NSP ELISA của UBI, Ceditest FMDV - NS của Cedi Diagnostics, Priocheck^®FMDV NS của Prionics.

- Phương pháp 3ABC - ELISA

Một trong những phương pháp chẩn đoán dựa vào việc xác định kháng nguyên không cấu trúc được sử dụng rộng rãi trên thế giới và đem lại hiệu quả cao là phương pháp 3ABC-ELISA. Phương pháp chẩn đoán này nhằm xác định kháng nguyên không cấu trúc 3ABC của virus LMLM. 3ABC được xác định là một trong những kháng nguyên có khả năng kích thích gia súc sinh đáp ứng miễn dịch cao nhất. Phương pháp 3ABC - ELISA được Bergmann cùng các cộng sự nghiên cứu,  đưa ra lần đầu tiên vào năm 1993 đã thu được nhiều thành công khi ứng dụng rộng rãi ở Nam Mỹ.

 Bộ kít thương mại được xây dựng dựa trên kĩ thuật 3ABC-ELISA được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm này là bộ Chekit–FMD-3ABC của Bommeli Diagnostics – Thụy Sỹ. Bộ kít này có những ưu điểm:

+ Cho phép phát hiện kháng thể 3ABC ở bò và cừu bị nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào sau 10-14 ngày và kéo dài 1 năm với độ chính xác tới 99,95%. Vì vậy, khi kết quả dương tính ta có thể kết luận trâu, bò bị nhiễm virus LMLM.

+ Dễ sử dụng do các thành phần phản ứng đã có sẵn, đồng thời phương pháp tiến hành đơn giản.

+ Kiểm tra khối lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.

+ Mỗi lần làm xét nghiệm có thể kiểm tra các mẫu của nhiều loài (trâu, bò, cừu).

5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT- PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985. Kỹ thuật PCR là một phương pháp tạo dòng invitro, cho phép khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và tương đối dài, mà không cần đến việc tách và nhân dòng (cloning). Với những virus thuộc loại virus RNA thì phải tiến hành thêm phản ứng sao chép ngược nhờ vào men sao chép ngược RT (Reverse Transcriptase) để chuyển RNA thành DNA. Sau đó, tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thông thường (OIE  SEAFMD RCU, 2000). Do đó kỹ thuật này được gọi là RT- PCR.

6. Phương pháp Realtime PCR

Nguyên lý phản ứng Realtime PCR

Phản ứng Realtime PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT-PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xẩy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Realtime PCR, hệ thống ghi được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuyếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuyếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại sẽ tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.

Virus Lở mồm long móng có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng Realtime PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA sang DNA gọi là Reverse trancription nên phương pháp này gọi là Realtime RT- PCR.

Nguyên lý hoạt động của Probe

Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Realtime RT-PCR là Taqman Probe, Taqman Probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman Probe, cùng với các primer.

Taqman Probe gắn một chất huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp phụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’- 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuyếch đại trong mẫu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Tiến Dũng (2000).Bệnh LMLM, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập VII (số 2).tr 8-16.
2. TCVN 8400-1:2010 (2019).Quy trình chẩn đoán-Bệnh lở mồm long móng.
3. Callis J.J., Kercher P.D. (1986).Foot and mouth disease, Disease of Swine. Sixth Edition IOWA State University press Ames Iowa, USA, pp 337-347.
4. Crowther  J.R.  and  Abu  Elzein  E.M.E.  (1979).Applic  the  enzym linked  immunosorbent  assay  to  the  detection  of  foot and  mouth  disease viruses, J.Hvq. Camb., 83, pp 513-519.
5. EUFMD (2013). Foot-and-Mouth Disease situation - Food and Agriculture Organization of the United Nations Monthly Report June 2013, FAO,December  11^st
6. OIE  SEAFMD  RCU  (2000).Report  to  the  FMD  commission,  The sixth meeting of the Sub – commission for FMD control in Hanoi.